ไฟเตส

การประยุกต์ใช้และหลักการของไฟเตส

ขั้นตอนนี้ใช้เพื่อตรวจสอบการทำงานของเอนไซม์ที่ปล่อยฟอสเฟตจากไฟเตต การทดสอบขึ้นอยู่กับการย่อยด้วยเอนไซม์ของโซเดียมไฟเตตภายใต้สภาวะควบคุมโดยการวัดปริมาณออร์โธฟอสเฟตที่ปล่อยออกมา

รีเอเจนต์และโซลูชั่น 
[หมายเหตุ: เครื่องแก้วทั้งหมดต้องล้างด้วยกรดล้างและทำความสะอาดอย่างพิถีพิถันเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีฟอสเฟต]
อะซิเตทบัฟเฟอร์ (pH 5.5) ละลายกรดอะซิติก 100% 1.76 กรัม (C2H4O2) โซเดียมอะซิเตทไตรไฮเดรต 30.02 กรัม (C2H3O2Na · 3H2O) และแคลเซียมคลอไรด์ไดไฮเดรต 0.147 กรัมในน้ำประมาณ 900 มิลลิลิตร เทสารละลายลงในขวดวัดปริมาตร 1,000 มล. เจือจางด้วยน้ำตามปริมาตรแล้วผสม pH ควรเป็น 5.50 ± 0.05
สารละลายพื้นผิวละลายโซเดียมไฟเตตเดคาไฮเดรต 8.40 กรัม (C6H6O24P6Na12 · 10H2O) (Sigma Chemical Co. ) ใน Acetate Buffer 900 มล. ปรับ pH เป็น 5.50 ± 0.05 ที่ 37.0 °± 0.1 °โดยเติมกรดอะซิติก 4 M เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบ โอนส่วนผสมในเชิงปริมาณไปยังขวดปริมาตร 1,000 มล. เจือจางเป็นปริมาตรด้วย Acetate Buffer และผสม เตรียมสดใหม่ทุกวัน
สารละลายกรดไนตริก (27%) ในขณะที่กวนให้ค่อยๆเติมกรดไนตริก 65% 70 มล. ลงในน้ำ 130 มล.
สารละลายแอมโมเนียมเฮปตาโมลิบดีนัมละลาย 100 กรัมของแอมโมเนียมเฮปตาโมลิเบดเตตระไฮเดรต [(NH4) 6Mo7O24 · 4H2O] ในน้ำ 900 มล. ในขวดปริมาตร 1,000 มล. เติมสารละลายแอมโมเนีย 25% 10 มล. เจือจางด้วยน้ำแล้วผสมให้เข้ากัน สารละลายนี้มีความคงตัวเป็นเวลา 4 สัปดาห์เมื่อเก็บไว้ที่อุณหภูมิแวดล้อมและป้องกันจากแสง
สารละลายแอมโมเนียมวานาเดตละลายแอมโมเนียมโมโนวานาเดต (NH4VO3) 2.35 กรัมในน้ำอุ่น 400 มล. (60 °) ในขณะที่กวนให้เติมสารละลายกรดไนตริก 20 มล. (27%) อย่างช้าๆ เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบ โอนส่วนผสมในเชิงปริมาณไปยังขวดปริมาตร 1,000 มล. เจือจางด้วยน้ำและผสม สารละลายนี้มีความคงตัวเป็นเวลา 4 สัปดาห์เมื่อเก็บไว้ที่อุณหภูมิแวดล้อมและป้องกันจากแสง
สารละลายสี / หยุดขณะกวนให้เติมสารละลายแอมโมเนียมวานาเดต 250 มล. ลงในสารละลายแอมโมเนียมเฮปตาโมลิเบต 250 มล. ค่อยๆเติมกรดไนตริก 65% 165 มล. เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบ โอนส่วนผสมในเชิงปริมาณไปยังขวดปริมาตร 1,000 มล. เจือจางด้วยน้ำและผสม เตรียมสดใหม่ทุกวัน
สารละลายโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตแห้งโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) ในปริมาณที่เพียงพอในเตาอบสุญญากาศที่อุณหภูมิ 100 °ถึง 104 °เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบในเครื่องดูดความชื้นเหนือซิลิกาเจลแห้ง
ในการทำซ้ำ (สารละลาย A และ B) ให้มีน้ำหนักประมาณ 0.245 กรัมของโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตที่แห้งอย่างถูกต้องภายใน 1 มิลลิกรัมและเจือจางด้วย Acetate Buffer ถึง 1 L เพื่อให้ได้สารละลายที่มีโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 1.80 mmol / L
การเตรียมการอ้างอิงไฟเตส (การเตรียมไฟเตสที่มีความเข้มข้นสูง) การเตรียมนี้สามารถหาได้จาก Gist-Brocades, Delft, เนเธอร์แลนด์โดยมีกิจกรรมที่ได้รับมอบหมาย (โดยการทดสอบร่วมกัน) หรือกิจกรรมของการเตรียมการอ้างอิงสามารถกำหนดได้ตามขั้นตอนที่ 2
Phytase Reference Solutions, ขั้นตอนที่ 1 ชั่งน้ำหนัก Phytase Reference Preparation ที่สอดคล้องกับ 20,000 หน่วย phytase อย่างแม่นยำถึงภายใน 1 มก. ในขวดปริมาตร 200 มล. ละลายและเจือจางเป็นปริมาตรด้วย Acetate Buffer แล้วผสม เจือจางด้วย Acetate Buffer เพื่อให้ได้การเจือจางที่มีประมาณ 0.01, 0.02, 0.04, 0.06 และ 0.08 หน่วยของไฟเตสต่อ 2.0 มล. ของการเจือจางขั้นสุดท้าย
การเตรียมตัวอย่างขั้นตอนที่ 1 ระงับหรือละลายและเจือจางปริมาณตัวอย่างที่ชั่งอย่างถูกต้องใน Acetate Buffer เพื่อให้ 2.0 mL ของการเจือจางขั้นสุดท้ายจะมีระหว่าง 0.02 ถึง 0.08 หน่วยของไฟเตส

การเตรียมตัวอย่างขั้นตอนที่ 2 ในการทำซ้ำให้ชั่งน้ำหนักปริมาณของ Phytase Reference Preparation อย่างถูกต้องและละลายและเจือจางใน Acetate Buffer เพื่อให้ได้การเจือจางที่มี 0.06 ± 0.006 หน่วย phytase ต่อ 2.0 mL ของการเจือจางขั้นสุดท้าย

ขั้นตอน
ขั้นตอนที่ 1 (การกำหนดกิจกรรมของไฟเตส) ถ่ายโอน 2.00 มล. ของการเตรียมตัวอย่างขั้นตอนที่ 1 และโซลูชันอ้างอิงของไฟเตสขั้นตอนที่ 1 ลงในหลอดทดลองแก้วขนาด 20 × 150 มม. ใช้นาฬิกาจับเวลาและเริ่มต้นที่เวลาเท่ากับศูนย์ตามลำดับของซีรีส์และภายในช่วงเวลาปกติวางท่อลงในอ่างน้ำ 37.0 °± 0.1 °และปล่อยให้เนื้อหาปรับสมดุลเป็นเวลา 5 นาที ในเวลาเท่ากับ 5 นาทีในลำดับเดียวกันของซีรีส์และในช่วงเวลาเดียวกันให้เติมสารละลายพื้นผิว 4.0 มล. (ก่อนหน้านี้ปรับสมดุลเป็น 37.00 ± 0.10) ลงในหลอดทดลองแต่ละหลอด ผสมและเปลี่ยนในอ่างน้ำ 37.0 °± 0.1 ° ในเวลาเท่ากับ 65 นาทีในลำดับเดียวกันและในช่วงเวลาเดียวกันให้ยุติการบ่มโดยการเติมสารละลายสี / หยุด 4.0 มล. ผสมและทำให้เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบ
เตรียมช่องว่างโดยการถ่ายโอน 2.00 มล. ของการเตรียมตัวอย่างขั้นตอนที่ 1 และโซลูชันอ้างอิงของไฟเตสขั้นตอนที่ 1 ลงในหลอดทดลองแก้วขนาด 20 × 150 มม. ใช้นาฬิกาจับเวลาและเริ่มต้นที่เวลาเท่ากับศูนย์ตามลำดับของซีรีส์และภายในช่วงเวลาปกติให้วางท่อลงในอ่างน้ำ 37.0 °± 0.1 °และปล่อยให้สมดุลเป็นเวลา 5 นาที ในเวลาที่เท่ากับ 5 นาทีตามลำดับเดียวกันของซีรีส์และในช่วงเวลาเดียวกันให้เติมโซลูชันสี / หยุด 4.0 มล. ผสมและทำให้เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบ จากนั้นเติม Substrate Solution 4.00 mL ลงในหลอดเปล่าแล้วผสม
หมุนเหวี่ยงหลอดทดลองทั้งหมดเป็นเวลา 5 นาทีที่ 3000 × g. กำหนดค่าการดูดซับของแต่ละสารละลายที่ 415 นาโนเมตรในเซลล์ความยาวเส้นทาง 1 ซม. ด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่เหมาะสมโดยใช้น้ำเป็นศูนย์เครื่องมือ
ขั้นตอนที่ 2 (การกำหนดกิจกรรมของไฟเตสของการเตรียมการอ้างอิงไฟเตส) ถ่ายโอนการเตรียมตัวอย่าง 2.00 มล. ขั้นตอนที่ 2 และ 2.00 มล. (สามเท่าจากโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตสารละลาย A และสองเท่าจาก B) ของสารละลายโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตแยกเป็น 20 - ×หลอดทดลองแก้ว 150 มม. ใช้นาฬิกาจับเวลาและเริ่มต้นที่เวลาเท่ากับศูนย์ตามลำดับของซีรีส์และภายในช่วงเวลาปกติวางท่อลงในอ่างน้ำ 37.0 °± 0.1 °และปล่อยให้เนื้อหาปรับสมดุลเป็นเวลา 5 นาที ในเวลาเท่ากับ 5 นาทีตามลำดับเดียวกันของซีรีส์และในช่วงเวลาเดียวกันให้เติมสารละลายพื้นผิว 4.0 มล. (ก่อนหน้านี้ปรับสมดุลเป็น 37.0 °± 0.1 °) ลงในหลอดทดสอบ ผสมและเปลี่ยนในอ่างน้ำ 37.0 °± 0.1 ° ในเวลาเท่ากับ 35 นาทีในลำดับเดียวกันและในช่วงเวลาเดียวกันให้ยุติการฟักตัวโดยการเติมสารละลายสี / หยุด 4.0 มล. ผสมและทำให้เย็นถึงอุณหภูมิโดยรอบ

เตรียมช่องว่างโดยการถ่ายโอนการเตรียมตัวอย่าง 2.00 มล. ขั้นตอนที่ 2 ลงในหลอดทดลองแก้วขนาด 20- × 150 มม. แยกกัน เตรียมช่องใส่น้ำยาโดยการถ่ายน้ำ 2.00 มล. ลงในหลอดทดลองแก้วขนาด 20- × 150 มม. เติมสารละลายสี / หยุด 4.0 มล. ลงในหลอดเปล่าทั้งหมดแล้วผสม จากนั้นเพิ่มพื้นผิว 4.0 มล. และผสม กำหนดค่าการดูดซับของแต่ละสารละลายที่ 415 นาโนเมตรในเซลล์ความยาวเส้นทาง 1 ซม. ด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่เหมาะสมโดยใช้น้ำเป็นศูนย์เครื่องมือ

การคำนวณ
การคำนวณขั้นตอนที่ 1 หนึ่ง Phytase (fytase) unit (FTU) คือปริมาณของเอนไซม์ที่ปลดปล่อยอนินทรีย์ฟอสเฟตที่ 1 µmol / min จากโซเดียมไฟเตต 0.0051 mol / L ที่ 37.00 ที่ pH 5.50 ภายใต้เงื่อนไขของการทดสอบ คำนวณค่าการดูดซับที่แก้ไขแล้ว (ตัวอย่างลบค่าว่าง) สำหรับการเตรียมตัวอย่างและโซลูชันอ้างอิงของไฟเตส พล็อตกิจกรรมของไฟเตสที่คำนวณได้อย่างแม่นยำ (FTU ต่อ 2 มล.) ของโซลูชันอ้างอิงของไฟเตสแต่ละรายการเทียบกับค่าการดูดซับที่สอดคล้องกัน จากเส้นโค้งให้กำหนดกิจกรรมของไฟเตสในการเตรียมตัวอย่างแต่ละครั้ง (FTU ต่อ 2 มล.):

กิจกรรม (FTU / g) = (FTU ต่อ 2 mL × dilution) / น้ำหนักตัวอย่าง (g)


การคำนวณขั้นตอนที่ 2 คำนวณการดูดซับที่แก้ไข AR สำหรับการเตรียมตัวอย่างแต่ละครั้ง (สารละลายอ้างอิงของไฟเตสลบด้วยค่าการดูดซับที่สอดคล้องกัน) และสำหรับสารละลายโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตแต่ละชนิด, Ap (สารละลายโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตการดูดซับลบด้วยรีเอเจนต์การดูดซับโดยเฉลี่ย) คำนวณ C ความเข้มข้นของฟอสเฟตของสารละลายโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต:

(W × 1,000 × 2) / MW = C (mmol / 2 mL)

คำนวณการดูดซับ D สำหรับสารละลายโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตแต่ละตัวหลังการแก้ไขสำหรับปริมาณโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตที่ชั่งน้ำหนัก:

Ap / C = D (หน่วยการดูดซับ / mmol ของฟอสเฟตต่อ 2 mL)

คำนวณค่าเฉลี่ยของผลลัพธ์ D ให้ E (ความแตกต่างสูงสุดที่ยอมให้ได้ 5%)
คำนวณกิจกรรมสำหรับการเตรียมการอ้างอิง Phytase แต่ละรายการ:

(AR × f) / (30 × R × E) = FTU / g,

ซึ่ง AR เท่ากับค่าการดูดซับที่ได้รับการแก้ไขของ Phytase Standard Solution f เท่ากับปัจจัยการเจือจางทั้งหมดของการเตรียมการอ้างอิง 30 เท่ากับเวลาฟักตัวเป็นนาที R เท่ากับน้ำหนักตัวอย่างเป็น g E เท่ากับค่าเฉลี่ยของปัจจัย D W เท่ากับน้ำหนักของโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตหน่วยเป็น g และ MW เท่ากับน้ำหนักโมเลกุลของโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 136.09 (g / mol)

ใบรับรองการวิเคราะห์

บรรจุภัณฑ์และการจัดเก็บ

ถุงบรรจุอาหารแข็ง 25 กก. / บาร์เรล

ไฟเตสควรเก็บไว้ในที่แห้งเย็นและมีอากาศถ่ายเทได้สะดวกห่างจากแสงแดดความร้อน

การชำระเงิน:T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-Checking, Pay Later, LC และอื่น ๆ